Дифференциальная экспрессия генов Две клетки дифференцированы поразному, если, обладая одинаковым геномом, они синтезируют разные белки. Φ. ЖАКОБ и Ж. МОНО (1963)
Лекции Р. П. Костюченко Дифференциальная экспрессия генов 1960 -е 1. Каждое ядро соматической клетки содержит полный геном, возникающий при оплодотворении яйцеклетки. Это означает, что ДНК во всех дифференцированных клетках идентична. 2. Неиспользуемые гены в дифференцированных клетках не подвергаются разрушению или мутациям, они сохраняют способность к экспрессии. 3. Только небольшой процент генома экспрессируется в каждой клетке, часть РНК, синтезируемой в клетке, специфична для данного типа клеток. Экспрессия гена - реализация генетической информации, закодированной в гене
Механизмы дифференциальной экспрессии генов. Эпигенетический ландшафт Уоддингтона. Шарик на вершине изображает клетку, а долины под ним - различные пути развития, по которым она может пойти.
Регуляция экспрессии генов ядро цитоплазма Контроль деградации м. РНК ДНК Первичный транскрипт м. РНК Контроль транскрипции м. РНК Процессинг РНК м. РНК Контроль транспорта м. РНК Контроль деградации белка Деградация белка Контроль трансляции м. РНК Деградация м. РНК Неактив ный белок Контроль ферментативной активности белка Активный белок
Нуклеосома - базовая единица хроматиновой структуры гистоны (две молекулы каждого из гистонов H 2 A-H 2 B и гистонов H 3 -H 4), обернутых двумя витками ДНК. Динамичная структура, сворачивается/разворачивается около 4 раз в секунду. Модификации гистонов: «гистоновый код» ацетилирование гистонов - активирует транскрипцию («разрыхляя» хроматин) деацетилирование гистонов – Инактивирует метилирование гистонов – при метилировании по «хвостам» H 3, Н 4 – уплотнение хроматина, умолкание генов, гетерохроматинизация. хроматин - комплекс ДНК с белком
Считывание гистонового кода. Комплекс считывания кода связывается специфически свяжется только с областью хроматина, содержащей распознаваемые им метки, так что только определенная комбинация меток вызовет связывание комплекса с хроматином и привлечет дополнительные белковые комплексы, которые катализируют одну или несколько биологических функций.
Факторы транскрипции - белки, контролирующие процесс синтеза м. РНК на матрице ДНК путём связывания со специфичными участками ДНК. Транскрипционные факторы выполняют свою функцию либо самостоятельно, либо в комплексе с другими белками. Они обеспечивают снижение (репрессоры) или повышение (активаторы) константы связывания РНК-полимеразы с регуляторными последовательностями регулируемого гена. Определяющая черта факторов транскрипции - наличие в их составе одного или более ДНК-связывающих доменов, которые взаимодействуют с характерными участками ДНК, расположенными в регуляторных областях генов.
Конститутивные ТФ - присутствуют всегда во всех клетках - главные факторы транскрипции. Активируемые ТФ (активны в определенных условиях) – Участвующие в развитии организма (клеткоспецифичные) - экспрессия строго контролируется, но, начав экспрессироваться, не требуют дополнительной активации -, Myo. D, Myf 5, Hox. Сигнал-зависимые - требуют внешнего сигнала для активации - внеклеточные сигнал-зависимые - внутриклеточные сигнал-зависимые - мембраносвязанные рецептор-зависимые - фосфорилируются киназами сигнального каскада ДНК-связывающий домен типа «лейциновая молния» в комплексе с ДНК. резидентные ядерные факторы - находятся в ядре независимо от активации - CREB, AP-1, Mef 2 латентные цитоплазматические факторы - в неактивном состоянии локализованы в цитоплазме, после активации транспортируются в ядро - STAT, R-SMAD, NF-k. B, Notch,
Сборка комплекса инициации транскрипции у эукариот на последовательности ТАТА. Структура комплекса TATAсвязывающего белка/транскрипционного фактора TF(II)B из археи Pyrococcus woesei с ДНК
Регуляторные белки эукариот собираются в комплексы на ДНК. Природа и функция такого комплекса зависит от специфической последовательности ДНК, которая служит затравкой для их сборки. Белки, которые не связываются самостоятельно с ДНК, но собираются на других связывающихся с ДНК регуляторных белках, часто называются коактиваторами или корепрессорами (кофакторами) транскрипции. Под этим термином могут пониматься комплексы перестройки хроматина (напр. гистонацетилазы), белки, усиливающие сродство полимеразного комплекса к ДНК, или же просто белки-”строительные леса”, служащие основой для прикрепления обладающих специфической активностью белков.
Объединение множества входящих сигналов на промоторе. Чтобы воздействовать на инициацию транскрипции на промоторе, многочисленные белковые комплексы работают сообща. Конечная транскрипционная активность гена является результатом конкуренции между активаторами и репрессорами.
Энхансеры ДНК-последовательности, которая селективно повышают активность промотора, контролируя частоту осуществляющейся с него инициации транскрипции. Связывают транскрипционные (ко)факторы, которые способны увеличивать уровень транскрипции.
Экпрессия Pax-6 Энхансеры могут контролировать временную и тканеспецифическую экспрессию любого дифференциально регулируемого гена, так что различные типы генов имеют как правило различные энхансеры
Лекции Р. П. Костюченко Сайленсеры Районы ДНК, которые отвечают за репрессию транскрипции какого-либо гена. (Посредством привлечения белков с соответствующей активностью) Нейроспецифический сайленсерный элемент (neural restrictive silencer element) - NRSE; найден в регуляторных районах нескольких мышиных генов, экспрессия которых ограничена нервной системой Нейроспецифический сайленсерный фактор (neural restrictive silencer factor) - NRSF , по- видимому, синтезируется в каждой клетке организма, не являющейся зрелым нейроном по Гилберт, 2010
Лекции Р. П. Костюченко Инсуляторы Чтобы предотвратить распространение влияние энхансера (сайленсера) на соседние гены существуют определенные участки ДНК, которые связывают белки, блокирующие действие регуляторного элемента на соседний промотор. по Гилберт, 2010
Возможные варианты регуляции инициации транскрипции у прокариот (а) Связывание активатора с лигандом стимулирует сборку комплекса и транскрипцию (б) Активатор стимулирует транскрипцию, при связывании с лигандом дезактивируется. (в)Репрессор запрещает транскрипцию. Взаимодействие с лигандом инактивирует репрессор и позволяет транскрипцию. (г) В отсутствие лиганда репрессор не способен взаимодействов ать с ДНК, репрессия происходит только в присутствие лиганда 21
Клеточные сигнальные пути Каскады межмолекулярных взаимодействий, обеспечивающие такую коммуникацию между клеточной мембраной и внутриклеточной точкой приложения, что способна привести к некоторым изменениям в клетке.
Точки приложения сигнальных каскадов Регуляция экспрессии генов (пролиферация, дифференцировка, выполнение функций) Изменение цитоскелета (изменение формы клетки, миграция, установление/разборка клеточных контактов) Влияние на метаболические пути (секреция метаболитов, регуляция активности ферментов) Не обязательно вовлекаются ДНК/РНК.
Способы передачи сигналов от клетки к клетке: Через воздействие паракринных факторов, взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом, через межклеточные контакты Диффузия растворимых сигнальных факторов Внеклеточный матрикс, секретируемый одной клеткой, вызывает изменения в другой Контакт между индуцирующей и отвечающей клетками
Источник сигнала Клетка-источник сигнала секретирует определённый тип сигнальной молекулы. Эта молекула детектируется клеткой-мишенью с помощью белка -рецептора, распознающего её и специфически с ней взаимодействующего. Каждая клетка способна отзываться на ограниченный набор сигнальных молекул. Реакция клетки на сигнал зависит от её состояния и типа дифференцировки.
Интеграция сигнала Сигналы из разных источников могут сходиться на The signals from several different sources may be integrated though a single shared protein (A) or protein complex (B) общем белке или белковом комплексе.
Амплификация сигнала 1 рецептор активирует множество G-белков 1 ligand-receptor 500 G-protein 500 enzymes Each enzyme Y produces many second messangers, each messanger activates 1 enzyme Y 105 (2 nd messanger) 250 (ion channels) 105 -107 (ions)
Ле Суперсемейство ростовых факторов TGF-β (TGF-β -суперсемейство) С другой стороны, структура белковучастников зачастую высококонсерватина. Зачастую белки, экспрессируемые в неродственном организме, способны функционально замещать гомологичные им белки хозяина. по Гилберт, 2010
Молекулярные взаимодействия Белок-белковые взаимодействия: ◦ Присоединение/диссоциация (Создание или разрушение белковых комплексов) ◦ Ковалентные модификации: фосфорилирование (tyr, thr, ser) ◦ Конформационные изменения ◦ Перемещение в другую функциональную область клетки ◦ Убиквитинирование и деградация Взаимодействие белков с малыми молекулами ◦ Присоединение/диссоциация, ведущая к изменению конформации, энергетического состояния ◦ Распространение вторичных мессенджеров (Ca 2+, ц. АМФ)
Фосфорилирование белков Привнесение двух отрицательных фосфатных зарядов может вызвать значительное конформационное изменение в белке за счёт, например, притяжения группы положительно заряженных боковых цепей аминокислот. Это может, в свою очередь, повлиять на связывание лигандов и тем самым заметно изменить активность фосфорилированного белка по сравнению с исходным.
Принципиальная схема влияния полученного сигнала на дифференциальную экспрессию генов Внешняя среда ядро цитоплазма Активный белок (1) Коактиваторы транскрипции Р Р Факторы транскрипции Перенос Активный белок (2) Лиганд Белок (2) Белковый комплекс Корепрессоры транскрипции Белок(2) n раз Деградация белка Белокрецептор
Лекции Р. П. Костюченко ПАРАКРИННЫЕ ФАКТОРЫ: сигнальный путь Wnt Семейство Wingless (Wnt-семейство) семейство гликопротеинов, богатых цистеином индуцируют дорсальные клетки сомитов становиться мышечными. участвуют в спецификации клеток среднего мозга Белки Wnt важны для становления полярности конечностей насекомых и позвоночных; они также участвуют в развитии (на различных этапах) мочеполовой системы Б - мочеполовой зачаток новорожденной самки мыши дикого типа. В - Мочеполовой зачаток самки мыши, нокаутированной по гену Wnt 4, с дефектом развития почки. Кроме того, яичник начинает синтезировать тестостерон и окружается системой протоков мужского типа. Фото J. Perasaari, S. Vainio
Лекции Р. П. Костюченко Юкстакринный (контактный) сигналинг: Сигнальный путь Notch. мембраносвязанные лиганды и рецепторы по Гилберт, 2010
Лекции Р. П. Костюченко Юкстакринный сигналинг первоначальные различия между клетками возникают случайно эти различия закрепляются по принципу обратной связи
Лекции Р. П. Костюченко Модель создания пространственной структуры нейробластов из исходно равноценных клеток нейрогенной эктодермы. Нейрогенные клетки производят сигнал в виде белка Delta (темная штриховка), а клетки, не становящиеся нейрогенными, продуцируют рецепторный белок Notch (белые)
Major themes in ST The “internal complexity” of each interaction The combinatorial nature of each component molecule (may receive and send multiple signals) The integration of pathways and networks
Краткое описание
Онтогенез – непрерывный процесс количественных и качественных изменений, происходящих в организме в течение всей жизни при постоянном взаимодействии генотипа и условий среды. Термины «онтогенез» и «филогенез» ввел в биологию зоолог Е.Геккель. Термин «онтогенез» означает процесс индивидуального развития особи, «филогенез» - история развития вида. Согласно биогенетическому закону индивидуальное развитие особи является как бы кратким повторением филогенеза.
Вступление
Что такое дифференцировка?
Цитогенетические основы дифференцировки в онтогенезе
Дифференцировка соматической клетки в онтогенезе
Дифференциальная экспрессия генов
Выводы
Список литературы
Вложенные файлы: 1 файл
Визуальное наблюдение в электронный микроскоп, как наиболее прямой подход к изучению уровня транскрипции, т.е. генной активности, проведено в отношении только отдельных генов - рибосомных, генов хромосом типа ламповых щеток и некоторых других. На элекгронограммах отчетливо видно, что одни гены транскрибируются активнее других. Хорошо различимы и неактивные гены.
Особое место занимает изучение политенных хромосом. Политенные хромосомы - это гигантские хромосомы, обнаруживаемые в интерфазных клетках некоторых тканей у мух и других двукрылых. Такие хромосомы есть у них в клетках слюнных желез, мальпигиевых сосудов и средней кишки. Они содержат сотни нитей ДНК, которые редуплицировались, но не подверглись расхождению. При окраске в них выявляются четко выраженные поперечные полосы или диски. Многие отдельные полосы соответствуют местоположению отдельных генов. Ограниченное число определенных полос в некоторых дифференцированных клетках образует вздутия, или пуфы, выступающие за пределы хромосомы. Эти вздутые участки находятся там, где гены наиболее активны в отношении транскрипции. Было показано, что клетки разного типа содержат разные пуфы. Изменения в клетках, происходящие в ходе развития, коррелируют с изменениями в характере пуфов и синтезом определенного белка. Других примеров визуального наблюдения генной активности пока нет.
Все остальные этапы экспрессии генов являются результатом сложных видоизменений продуктов первичной генной активности. Под сложными изменениями подразумевают посттранскрипционные преобразования РНК, трансляцию и посттрансляционные процессы.
Имеются данные по изучению количества и качества РНК в ядре и цитоплазме клеток организмов, находящихся на разных стадиях эмбрионального развития, а также в клетках различных типов у взрослых особей. Обнаружено, что сложность и число различных видов ядерной РНК в 5-10 раз выше, чем мРНК. Ядерные РНК, которые представляют собой первичные продукты транскрипции, всегда длиннее, чем мРНК. Кроме того, ядерная РНК, изученная на морском еже, по количеству и качественному разнообразию идентична на различных стадиях развития особи, а мРНК цитоплазмы отличается.в клетках разных тканей. Это наблюдение приводит к мысли о том, что посттранскрипционные механизмы влияют на дифференциальную экспрессию генов.
Примеры посттранскрипционной регуляции экспрессии генов на уровне процессинга известны. Мембранно-связанная форма иммуноглобулина IgM у мышей отличается от растворимой формы дополнительной аминокислотной последовательностью, позволяющей мембранно-связанной форме «заякориваться» в клеточной мембране. Оба белка кодируются одним локусом, но процессинг первичного транскрипта протекает по-разному. Пептидный гормон кальцитонин у крыс представлен двумя разными белками, детерминированными одним геном. У них одинаковые первые 78 аминокислот (при общей длине 128 аминокислот), а различия обусловлены процессингом, т.е. опять наблюдается дифференциальная экспрессия одного и того же гена в различных тканях. Есть и другие примеры. Вероятно, альтернативный процессинг первичных транскриптов играет очень важную роль в дифференцировке, однако остается неясным его механизм.
Большая часть мРНК цитоплазмы одинакова по качественному составу в клетках, относящихся к различным стадиям онтогенеза. мРНК необходимы для обеспечения жизнедеятельности клеток и детерминируются генами «домашнего хозяйства», представленными в геноме в виде нескольких нуклеотидных последовательностей со средней частотой повторяемости. Продуктами их активности являются белки, необходимые для сборки клеточных мембран, различных субклеточных структур и т.д. Количество этих мРНК составляет примерно 9/10 от всех мРНК цитоплазмы. Остальные мРНК являются необходимыми для определенных стадий развития, а также различных типов клеток.
При изучении разнообразия мРНК в почках, печени и головном мозге мышей, в яйцеводах и печени кур было обнаружено около 12000 различных мРНК. Лишь 10-15% были специфичны для какой-либо одной ткани. Они считываются с уникальных нуклеотидных последовательностей тех структурных генов, действие которых специфично в данном месте и в данный момент и которые называются генами «роскоши». Количество их соответствует примерно 1000-2000 генов, ответственных за дифференцировку клеток.
Не все гены, имеющиеся в клетке, вообще реализуются до этапа образования мРНК цитоплазмы, но и эти образовавшиеся мРНК не все и не во всяких условиях реализуются в полипептиды и тем более в сложные признаки. Известно, что некоторые мРНК блокируются на уровне трансляции, будучи в составе рибонуклеопротеиновых частиц - информосом, вследствие чего происходит задержка трансляции. Это имеет место в овогенезе, в клетках хрусталика глаза.
В ряде случаев окончательная дифференцировка связана с «достройкой» молекул ферментов или гормонов или четвертичной структуры белка. Это уже посттрансляционные события. Например, фермент тирозиназа появляется у зародышей амфибий еще в раннем эмбриогенезе, но переходит в активную форму лишь после их вылупления.
Другим примером является дифференцировка клеток, при которой они приобретают способность реагировать на определенные вещества не сразу после синтеза соответствующего рецептора, а только в определенный момент. Показано, что мышечные волокна в своей мембране имеют рецепторы к медиаторному веществу ацетилхолину. Интересно, однако, что эти холинорецепторы обнаруживали внутри цитоплазмы клеток-миобластов до образования ими мышечных волокон, а чувствительность к ацетилхолину возникала только с момента встраивания рецепторов в плазматическую мембрану во время образования мышечных трубочек и мышечных волокон. Этот пример показывает, что экспрессия генов и тканевая дифференцировка могут регулироваться после трансляции в процессе межклеточных взаимодействий.
Исследуя все выше сказанное мы можем сделать выводы: дифференцировка клеток не сводится только к синтезу специфических белков, поэтому применительно к многоклеточному организму эта проблема неотрывна от пространственно-временных аспектов и, следовательно, от еще более высоких уровней ее регуляции, нежели уровни регуляций биосинтеза белка на клеточном уровне. Дифференцировка всегда затрагивает группу клеток и соответствует задачам обеспечения целостности многоклеточного организма.
Список литературы
- “Современная генетика” Айала Ф., Кайгер Дж., М. 1987г.
- Корочкин Л.И. “Взаимодействие генов в развитии”, М. 1977 г.
- «Генетика» Меркурьева Е.К. и др. М.1991г.
- http://5fan.ru/wievjob.php?id= 6571
- http://afonin-59-bio.narod.ru/ 2_heredity/2_heredity_self/hs_ 16_onto.htm
Большинство генов эукариот, в отличии от генов прокариот имеют прерывистую структуру. Относительно короткие кодирующие участки (экзоны) чередуются с некодирующими участками (интроны). Регуляторные элементы гена - промоторы, определяющие точность инициации, транскрипции, локализованы перед первым экзоном на 5"-конце нити ДНК и представлены несколькими элементами (ТАТА-, ССААТ-боксы, GC-мотив).
Экспрессия генов регулируется также усилителями (энхансеры), ослабителями (сайленсоры), а также инсуляторами (ограничители действия энхансеров) и элементами отклика, взаимодействующими с факторами транскрипции, ксенобиотиками, стероидными гормонами и др. Эти последовательности участвуют в определении частоты инициации транскрипции .
Первый этап реализации генетической информации - транскрипция. Гены эукариот транскрибируются в виде предшественника, который состоит из экзонов и интронов (незрелая иРНК). Затем интроны вырезаются специальными ферментами, а экзоны последовательно сшиваются друг с другом, формируя готовый для трансляции транскрипт (зрелая иРНК). Этот процесс получил название сплайсинга. Одна и та же последовательность ДНК может кодировать несколько различных белков, благодаря так называемому альтернативному сплайсингу (образование разных иРНК за счет изменения чередования соединения экзонов из одного первичного РНК-транскрипта).
После транскрипции или параллельно с ней незрелая иРНК подвергается дальнейшей модификации. К 5"-концу пре-иРНК с помощью фермента присоединяется метилированный остаток гуанина в 7-м положении пуринового кольца (процесс копирования). Считается, что кэп (шапочка) необходима для правильной ориентации и присоединения рибосом к иРНК перед началом трансляции. К З"-концу пре-иРНК также ферментативно присоединяется короткая нуклеотидная последовательность, состоящая из остатков аденина (полиаденилирование). Полагают, что поли-А-последовательность необходима для транспорта иРНК через ядерную мембрану в цитоплазму .
По выполняемой функции в клетке эукариотические гены делятся на несколько групп.
Первую группу составляют гены, экспрессирующиеся во всех типах клеток. Продукты их деятельности - белки, необходимые для обеспечения жизнедеятельности любой клетки организма (гены рибосомальных РНК, гистонов и др.).
Вторая группа - тканеспецифические гены, которые функционируют только в определенных типах клеток или тканях на определенных стадиях онтогенеза (гены глобулинов, альбумина, а-фетопротеина, иммуноглобулинов, мышечных белков, секреторных белков эндокринных и пищеварительных желез и многие другие).
Третью группу составляют гены, которые кодируют различные белки, участвующие в регуляции транскрипции (транскрипционные факторы). Белковые продукты этих генов взаимодействуют с регуляторными участками генов, вызывая усиление или подавление экспрессии.
К четвертой группе относят гены, экспрессия которых индуцируется внешними факторами, в том числе ксенобиотиками.
Одной из основных задач фармакогеномики является изучение экспрессии генов при различных заболеваниях и воздействии того или иного лекарства или биологически активного соединения. Это позволит определять возможность их направленной регуляции.
Успешное внедрение фармакогеномики в экспериментальную фармакологию стало возможным благодаря развитию соответствующих технологий в том числе и информационных (биоинформатика). Все они ассимилировали и интегрировали фармакогенетику в широкое научное направление.
В целом, все методы ДГЭ состоят из множества, часто повторяющихся одних и тех же операций. Выполнение их вручную малоинтересное занятие. Однако угрозой не является монотонная работа оператора, а значительно большей проблемой считается бесконечное повторение одних и тех же операций, что может привести к потере точности. Поэтому перед фармакогеномическими технологиями стоит одна задача - частичная или полная автоматизация аналитических операций.
Основой любой технологии является метод, имеющий в аналитической практике свои характеристики (параметры). Для ДГЭ они должны соответствовать следующим требованиям:
Разрешающая способность, связана с определенной точностью определения соседних генов;
Чувствительность - граница «-последовательностей разведения, дающих возможность статистически достоверно регистрировать изменения ДГЭ;
Охват - процент экспрессированных генов данного вида экспериментальных животных или определенной ткани, которые могут быть надежно определены и экспериментально повторяться;
Фальшпозитивная норма - количество генов, ошибочно отнесенных к экспрессированным;
Фальшнегативная норма - количество экспрессированных генов, однако отнесенных к неактивным.
Технологии ДГЭ включают две группы методов. Одна из них, так называемая закрытая, а вторая - открытая архитектурная система .
Закрытая архитектурная система требует информацию о каждом гене или клоне и использует в качестве анализатора микрочипы.
Теория создания микрочипов основана на гибридизации олигонуклеотидов известной последовательности, иммобилизованных на твердой поверхности в строго определенных местах, с меченой различными способами пробой. Способствовали созданию данной технологии последние достижения в информатике, химии полупроводников, микроэлектронной промышленности, а также обилие информации, которая накопилась за годы работы над программой «Геном человека».
ДНК-чип - миниатюрная пластина с микроячейками. Каждая микроячейка содержит искусственно синтезированные олигонуклеотиды, соответствующие фрагментам определенных генов, выступающих в качестве матрицы. В этих ячейках происходит комплементарное взаимодействие матрицы и пробы (кДНК исследуемых образцов). В настоящее время существует два направления в создании ДНК-чипов. Они различаются способом синтеза и нанесения матричных олигонуклеотидов .
Первое направление основано на предварительном синтезе олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды синтезируют химически или с помощью ПЦР (длина от 500 до 5000 оснований) и затем наносят на обработанную специальным образом стеклянную поверхность с помощью роботов. Такие типы чипов получили название кДНК-микрочипов (cDNA-microarray). В ПЦР ампли- фицируются последовательности кДНК определенных генов. Поэтому данный тип чипов дорогостоящий, так как необходимо создавать собственную кДНК-библиотеку или приобретать ее у крупных исследовательских центров.
кДНК-Микрочипы оказались непригодными для проведения исследований полиморфизма (генетическая изменчивость отдельного локуса в определенной популяции), мутационного анализа, сравнительного изучения экспрессии большого количества генов, так как плотность размещения матричных олигонуклеотидов очень ограничена (число ячеек составляет = 1000 на чип). Кроме того, применение длинных фрагментов ДНК (кДНК) снижает специфичность гибридизации с исследуемой пробой и появляются ложноположительные сигналы, не соответствующие реальной экспрессии генов.
Несмотря на перечисленные недостатки, основное преимущество кДНК-микрочипов - возможность варьирования качественным и количественным составом фрагментов генов.
Более перспективное направление создания чипов - применение фотолитографических технологий , которые дают возможность одновременно интегрировать огромное количество олигонуклеотидов любой последовательности непосредственно на поверхности чипа. Плотность размещения синтезированных таким образом нуклеотидов может достигать 1 млн. на 1 см2. Такие чипы, получившие названия ДНК-чипов (DNA-chips), производятся фирмой Affymetrix Inc. Матрица ДНК-чипа - короткая (20-25-мерная) олигонуклеотидная последовательность, причем каждому гену соответствует 15-20 таких олигонуклеотидов, что значительно повышает точность и воспроизводимость результатов. ДНК-чипы позволяют одновременно оценивать экспрессию практически неограниченного количества генов, производить исследование полиморфизма, в том числе и однонуклеотидных замен (SNP). В этом случае синтезируются олигонуклеотиды, специфические для каждой последовательности конкретного гена, учитывая все возможные варианты взаимного расположения нуклеотидов.
При проведении исследований чип гибридизуется с меченой различными способами пробой. При сравнительных исследованиях пробой, как правило, служит кДНК, полученная из контрольного и сравниваемого образцов. В качестве метки используются как радиоактивно меченые молекулы, так и флуоресцентные красители, непосредственно присоединенные к исследуемым образцам. При проведении сравнительного анализа обычно применяют двухцветную детекцию, при которой контрольная и опытная кДНК метятся разными красителями. Результаты регистрируют по интенсивности гибридизационных сигналов тех ячеек чипа, где произошла гибридизация, с последующей компьютерной обработкой данных.
Производятся и упрощенные варианты чипов с небольшим набором генов (в пределах 1000-2000). На нейлоновой мембране фиксируются короткие последовательности известных генов. Они гибридизуются с радиоактивно меченой пробой. Гибридизация детектируется методом радиоавтографии.
Следует отметить, что работа с чипами требует специального дорогостоящего оборудования для проведения гибридизации. Ожидается, что в ближайшие годы цены на комплекты оборудования для производства чипов и работы с ними будут снижены в связи с насыщением рынка.
Разработка и внедрение в науку и практику новых технологий часто является движущим моментом в развитии медикобиологических отраслей знаний как, например, это было с разработкой в недавнем прошлом технологии ПЦР. Развитие молекулярной биологии в настоящее время многим обязано ПЦР, а теперь и микрочипам. Внедрение технологии микрочипов принципиально и для фармакологии. Разработка новых лекарственных средств уже сейчас начинает основываться на информации о функциональной роли определенных генов в развитии патологии. Поэтому сроки разработок могут сократиться с 10-15 до 5-8 лет }
